Masterbloggen

Labrottas leddgiktsforskning

Lesetid: 5 minutter

Forfatter: Trine Skuland
Tittel: Karakterisering av DKK1, OPG, RANKL og TLR’er i SW982 cellemodell for synovitt
Universitet: Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet (NTNU)
Fagretning: Celle- og molekylærbiologi

Det å jobbe som hvitfrakk-forsker er tidskrevende nøyaktighetsarbeid. På laben studerer jeg proteiner involvert i leddgikt. Men hva gjør jeg egentlig for å finne ut av ting og tang?

I mitt tilfelle starter det hele med SW982-cellene, som jeg bruker som en cellemodell for leddbetennelse. Som dere kanskje husker fra forrige innlegg, har cellen en proteinoppskrift inni kjernen sin, i form av DNA. Jeg prøver i første omgang å finne ut om de utvalgte proteinene i min masteroppgave, som er sentrale i utvikling av leddgikt, er mer eller mindre uttrykt ved stimulering med visse betennelsesstoffer enn uten stimulering.

Inspisere, sulte og stimulere celler

For å finne ut av dette må jeg da først være sikker på at cellene er i god form, det vil si at de viser vanlig vekst og morfologi og at de ikke har bakterieinfeksjon. Ja, celler i kultur kan få bakterieinfeksjoner de også. Da må vi eventuelt gi de antibiotika, akkurat slik man må når de får infeksjon i kroppen vår. Hvis cellene ser normale ut, kan jeg så de ut i 6-brønners brett, slik som vist på figur 1. Vi sår ut rundt 400 000-600 000 celler per brønn. For å vite hvor mange celler man har, må man bruke et såkalt tellekammer. Det er en slags glassplate med rutenett som man tilsetter en dråpe cellesuspensjon på.

I lysmikroskopet kan man så telle cellene i et visst system i rutenettet. Når jeg vet hvor mange celler jeg har per ml, kan jeg så de ut i brønnene ved hjelp av en elektronisk pipette som spytter ut nøyaktig det man stiller den inn på i den hastigheten man ønsker. Den gjør det mulig å dekke hele brønnen med celleløsningen.

Etter at cellene har stått og kost seg med cellemedium i inkubatorskapet i noen dager, har de vokst i et tett lag i brønnene. Da ”sulter” jeg de ved å tilsette et annet medium, som gjør at de slutter å vokse og utføre metabolsk aktivitet. De sultes over natten og er da klare for å stimuleres med
 betennelsesstoffer.

Få tak i oppskriften

Cellene stimuleres i antall ønskede timer, før jeg så lyserer de. Det betyr at jeg bruker en løsning som ødelegger cellene, slik at alt innholdet frigjøres. Blant dette innholdet befinner cellenes RNA seg. Som jeg skrev i forrige innlegg, kan ikke DNAet gå direkte ut av cellenes kjerne. Det må omskrives til en form som kan forlate cellekjernen, nemlig RNA. Utenfor kjernen produserer så bakerne (ribosomene) ulike proteiner med aminosyrer ut fra den omskrevne oppskriften. Det jeg ønsker å få tak i er nettopp RNAet, slik at jeg kan finne ut om de stimulerte cellene har mer eller mindre av de RNA-typene som er oppskriften på de proteinene jeg er interessert i. Dette gjøres ved å isolere RNA, slik at resten av celleinnholdet skilles ut og tas bort. Isoleringen utføres vha. en kolonne hvor RNA-molekylene binder til et filter i kolonnen, mens resten av celleinnholdet vaskes bort og renner gjennom. Da sitter jeg forhåpentligvis igjen med rent RNA, og dette måler jeg konsentrasjonen av for å finne ut hvor mye jeg har fått ut.

Undersøke genuttrykk

Det har seg slik at alle celletypene i kroppen vår har samme DNA med de samme genene. Det som gjør at cellene ser forskjellige ut og har forskjellige funksjoner er at de uttrykker ulike gener. Det vil si at de dermed produserer ulike RNA og tilsvarende ulike proteiner. Når jeg har isolert RNA fra cellene mine sitter jeg jo da igjen med mange typer RNA. Jeg ønsker bare å undersøke hvor mye det er av de RNA-typene som koder for mine utvalgte proteiner.

Dette gjøres ved å utføre noe som kalles for ”quantitative polymerase chain reaction” (qPCR). Fordi RNA er såpass ustabilt og lett degraderes, må jeg omdanne det til DNA igjen før jeg kan bruke det i qPCR. Det kalles da for komplementært DNA (cDNA). Dette er en prosess som ikke skjer i vanlige celler, men enkelte virus kan utføre det. Derfor bruker vi et enzym (katalysator i biologiske reaksjoner) fra et virus til å utføre syntese av cDNA.

QPCR er en laboratorieteknikk som brukes for å kvantifisere genuttrykk, det vil si å finne ut hvor mye cDNA, og dermed også RNA, av en viss type som er tilstede. For at kun de ønskede cDNA-typene skal undersøkes, bruker man såkalte primere i reaksjonen, som binder kun til de ønskede typene. Her gjelder det å holde tunga rett i munnen. Jeg må nemlig pipettere små mengder av de ulike cDNA-prøvene og andre reagenser for hånd i opptil 96 brønner i et slikt brett som du ser på figur 3. Uten å gå mer i dybden på selve prosessen som skjer, resulterer qPCR i en rekke tall. Disse bruker jeg så til å regne ut hvor mye opp- eller nedregulert de bestemte genene jeg forsker på er.

Fremtidige forsøk

For tiden driver jeg og prøver å finne ut hvilken stimuleringstid som er optimal å bruke for å få størst mulig forskjell i genuttrykk mellom med og uten stimulering. Når jeg har funnet det optimale tidspunktet, skal jeg bruke det i senere forsøk. Da skal jeg stimulere cellene med de samme betennelsesstoffene, men i tillegg også en eller flere forbindelser som hemmer enzymet fosfolipase A2 (PLA2). Jeg ønsker å finne ut om dette enzymet er en regulator for de proteinene jeg undersøker uttrykk av. Hvis nivået av de bestemte RNA-typene går tilbake til det normale nivået etter stimulering med både betennelsesstoff og PLA2-hemmer, vil dette da si at PLA2 er involvert i uttrykk av de genene jeg forsker på. En slik PLA2-hemmer vil da kunne forskes videre på som et potensielt terapeutisk middel mot leddgikt.