Masterbloggen

Fornøyd, vordende bioteknolog

Lesetid: 4 minutter

To års masterarbeid nærmer seg slutten. Hva har jeg egentlig funnet ut?

Jeg må si at det er ganske givende med medisinsk forskning – så lenge man er klar over at ting tar ca. fem ganger så lang tid som man har planlagt. Det er gøy å tenke på at ingen har funnet ut akkurat det samme som meg, og at funnene faktisk kan få betydning.

På sporet av noe

De nye oppdagelsene mine blir en del av det å kartlegge flere av signaliseringshendelsene som finner sted i cellene når man får leddgikt. En bedre og bredere forståelse av signalsporene kan bidra til utvikling av nye og mer effektive medisiner. Jeg har gjort fire hovedfunn:

1. Jeg har vist at SW982 synoviocytter, altså en type leddhinneceller, uttrykker visse Toll-lignende reseptorer, eller Tor’er som dere kjenner de som. Som dere kanskje husker fra tidligere innlegg, er disse å finne på celler i det medfødte immunforsvaret og gjenkjenner bakterier og virus, men også enkelte stoffer som finnes i betente ledd. De er med på å aktivere andre deler av immunforsvaret slik at inntrengere kan fjernes, og betennelsen vil da opphøre. Ved leddgikt derimot, vedvarer denne betennelsetilstanden. Det skjer fordi celler produserer antistoffer som binder til noen av kroppens egne komponenter og reagerer på disse, istedet for stoffer fra for eksempel inntrengende bakterier. Det er også mulig at den vedvarende betennelsen holdes ved like fordi Tor’er binder til enkelte stoffer som produseres i betente ledd, og dermed stadig aktiverer immunforsvaret.
2. Jeg har sett at når noen av Tor ‘ene aktiveres øker nivået av OPG, eller Olga som jeg har kalt det. Denne økningen skjer både på gen- og proteinnivå. Olga er med på å forhindre dannelse av den celletypen som bryter ned bein. Hos leddgiktpasienter ser man nemlig en økt beinnedbrytning, noe som tyder på at de har for lite Olga. Det at Tor-aktivering gjør at mer Olga dannes, vil altså være fordelaktig ved leddgikt, fordi da vil beinnedbrytningen reduseres.
3. Jeg har også funnet ut at aktivering av visse Tor ‘er fører til økt frigjøring av arakidonsyre. Arakidonsyre omdannes videre til andre stoffer som bidrar til betennelse, som ved leddgikt. Det betyr at økt produksjon av arakidonsyre ikke er ønskelig.
4. Jeg har vist at det er enzymet cytoplasmisk fosfolipase A2 som sannsynligvis er hovedansvarlig for den økte arakidonsyre-frigjøringen. Trolig er enzymet kalsium-uavhengig fosfolipase A2 også involvert. Dette betyr at det å hemme disse typene fosfolipase-enzymer vil kunne redusere mengden arakidonsyre som dannes, og dermed også redusere dannelsen av betennelseskomponenter. Men vil dette gi negative bivirkninger? Det er noe man må forske videre på.

Bioteknologiens sandwich

For å få litt ekstra krydder til masteroppgaven min, har jeg drevet med proteinanalyser nå mot slutten. Som nevnt over har jeg har allerede funnet ut at cellene produserer økt nivå av Olga-proteiner når noen av Tor-reseptorene deres aktiveres.

Hvordan finner man så ut hvor mye Olga-protein cellene har produsert, spør du? Jo, nå skal du høre! Det er ved hjelp av en metode som så fint kalles “enzyme-linked immunosorbent assay” og har forkortelsen ELISA, som jo passer fint inn i min rekke av menneskenavn. Den typen jeg gjør heter sandwich ELISA, fordi Olga blir sandwichet mellom to antistoff. Prinsippet for denne metoden er illustrert i figur 1.

ELISA farger hverdagen

Jeg tar et plastikkbrett med 96 brønner og  tilsetter først det som på figuren er blått og kalles “capture Ab”. Dette er et antistoff som binder målproteinet, altså Olga – vist som en stor, grønn klump på figuren. Det blå antistoffet setter seg fast på bunnen av brønnene. Deretter tilsetter jeg cellemediet som har ligget over cellene når de har blitt stimulert med de stoffene som aktiverer Tor-reseptorene. Det er altså i cellemediet jeg måler hvor mye Olga cellene har skilt ut etter stimulering.

Videre tilsetter jeg en annen type antistoff som kalles “detection Ab” – det røde på figuren. Dette binder også til grønne Olga, men på en annen plass enn det første blå antistoffet. “Detection Ab” har i tillegg et oransje molekyl som kalles biotin bundet til enden. Det som er så fint med biotin er at det liker å feste seg til et stoff som rimer på seg selv, nemlig den mørkegrønne rundingen streptavidin. Det at biotin og streptavidin er så gode venner utnytter man ofte i biokjemiske analyser. Her i sandwich ELISA for eksempel, har streptavidin blitt festet til et enzym som heter pepperot-peroksidase – den lille lysegrønne ballen forkortet med HRP på figuren. Dette enzymet omdanner et gjennomsiktig stoff til et blåfarget produkt. Mengden blåfarge som dannes avhenger av mengden enzymer som finnes, som igjen avhenger av hvor mange “detection Ab” som har bundet Olga. Det vil dermed si at jo mer blåfarget løsningen er, jo mer Olga er tilstede. Plastikkbrettet ser ganske fancy ut nå, som du kan se på figur 2. Gøy med litt farger i labhverdagen!

Blått blir til gult

Blåfargen i brønnene blir med ett gul når jeg tilsetter svovelsyre, som fungerer ved å stoppe reaksjonen. Dermed kan jeg bestemme fargeintensiteten ved å måle absorbansen i de ulike brønnene ved hjelp av en plateleser, som vist på figur 3. Man lager først en standardkurve ut fra et Olga-protein som kommer ferdig renset og har kjent konsentrasjon. Ved hjelp av absorbansverdiene kan jeg ut fra standardkurven beregne konsentrasjonen av Olga-protein i cellemedieprøvene mine. Fiffig, eller hva?

7 + 7 er 14, innspurten venter i porten

Det er ikke langt igjen til mål nå. Men nå skal jeg til å knote med å lage grafer, tabeller og alskens illustrasjoner for å få frem resultatene mine på en best mulig måte. Og ikke minst, jeg må få til en heidundrende bra diskusjon som vurderer alle aspekter av det jeg har gjort. Dette kommer nok også til å ta lenger tid enn jeg har planlagt. Midt oppi all skrivinga skal jeg i tillegg ha et intensivfag om patentering, hvor vi skal levere oppgave og greier. Kryss fingrene for at jeg rekker over alt!